Protein-Koexpression während der EMT sichtbar machen und verstehen


Eingestellt von Tamar A. am 07. Aug. 2019 03:10:00

Eine sorgfältige Planung und die Feinabstimmung der experimentellen Protokolle sind der Schlüssel zu klaren, interpretierbaren wissenschaftlichen Ergebnissen. Das gilt ganz besonders für Immunhistochemie (IHC)-Studien, in denen jeder Schritt des oftmals Tage andauernden Prozesses – von der Gewebepräparation bis hin zur Entwicklung der Färbung – das letztendliche Ergebnis und die Analyse erheblich beeinflussen kann. Oftmals ist eine Untersuchung mehrerer Antigene gleichzeitig erforderlich, um spezielle wissenschaftliche Fragestellungen zu bearbeiten, was die Entwicklung eines IHC-Protokolls zusätzlich verkompliziert. Ein generelles Verständnis der Schritte, die zur Optimierung der IHC für mehrere Zielantigene notwendig sind, ist zum Erzielen zuverlässiger Ergebnisse essentiell. Was also sind diese Schritte?

Lassen Sie uns erst die grundlegenden Prinzipien der Immunhistochemie durchgehen, bevor wir die Leitlinien für eine Doppelfärbung darstellen. Die IHC wird seit langem als ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel in der Medizin eingesetzt und ebenfalls als ein Forschungswerkzeug in der Grundlagenforschung. Die IHC ist eine „informationsreiche“ Methode, weil sie Wissenschaftler nicht nur befähigt, zu bestimmen, ob ein Zielantigen von Interesse anwesend ist, sondern auch zu erkennen, wo es im nativen histologischen Kontext der Probe exprimiert wird. Durch die gleichzeitige Färbung mehrerer Antigene, bietet die IHC die Möglichkeit, ganz neue Einsichten in die zugrunde liegenden biologischen Prozesse zu liefern, oder zwischen normalen und krankhaften Zuständen zu unterschieden.

Doppelfärbung IHC EMT

Die IHC funktioniert, indem sie sich spezifische Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und Antigenen zunutze macht, und zusammen mit einer Nachweismethode eine Reaktion hervorruft, die im Mikroskop sichtbar ist. Die am häufigsten untersuchten Antigene sind zelluläre Proteine von Interesse. Aber auch Kohlenhydrate und, in manchen Fällen, Nukleinsäuren können mittels IHC untersucht werden.

Die wichtigste Komponente jedes IHC-Experiments ist, neben der Gewebepräparation, der primäre Antikörper, da er die Spezifität der IHC-Reaktion direkt beeinflusst. Primäre Antikörper, die in der IHC verwendet werden, liegen in zwei Formen vor: polyklonal und monoklonal. Polyklonal bezieht sich auf eine Sammlung von Antikörpern, die in ein und demselben Wirt erzeugt wurden, und die mehrere Regionen, oder Epitope, eines Zielantigens erkennen. Monoklonal bezeichnet hingegen einen einzelnen Antikörper, der an ein bestimmtes Epitop bindet. Jede Antikörper-Klasse kann durch die Immunisierung mit dem gewünschten Antigen in einer ganzen Reihe von Wirten hergestellt werden – von Kaninchen bis hin zu Ziegen. Anschließend findet eine Aufreinigung direkt aus Serum statt oder die antikörperproduzierenden B-Zellen werden für die Entwicklung von Hybridomen isoliert.

Der Nachweis der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung kann mit einer Reihe von Methoden erfolgen. Eine Option ist die direkte Konjugation einer Fluoreszenzmarkierung (Tag) oder eines chromogenen Enzyms wie der Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) an den primären Antikörper. Der gebräuchlichere Ansatz ist jedoch die Verwendung markierter sekundärer Antikörper, die das Gerüst eines primären Antikörpers, die schwere Kette, auf eine Spezies-spezifische Art und Weise erkennen und binden. Die Verwendung sekundärer Antikörper bietet im Vergleich zur direkten Konjugation mehrere Vorteile. Dazu gehören eine Verstärkung des Signals und die Flexibilität, sie in Kombination mit mehreren verschiedenen primären Antikörpern zu verwenden, was Kosten einspart. Und schließlich können voneinander unabhängige chromogene oder fluoreszente Tags für den mehrfarbigen Nachweis mehrerer verschiedener primärer/sekundärer Antikörper in derselben Gewebeprobe eingesetzt werden.

Das bringt uns zu unserer Eingangsfrage zurück: Welche Schritte sind notwendig, um einen gleichzeitigen Nachweis zweier Antigene mittels IHC zu optimieren? Erstens, es sollten validierte primäre Antikörper gegen die zu untersuchenden Zielantigene ausgesucht werden, die idealerweise in unterschiedlichen Wirtsarten erzeugt wurden und diese sollten mit Spezies-spezifischen sekundären Antikörpern für den Nachweis kombiniert werden. Diese generell gültige Regel beseitigt die Bedenken in Bezug auf Kreuzreaktivität während der Färbung. Als nächstes müssen die Färbungsparameter für jeden primären Antikörper parallel ausgetestet werden. Dies umfasst die Bestimmung der geeigneten Antikörper-Konzentration, Inkubationszeit und -temperatur und die Paarung der Chromogene, um Ergebnisse mit der größten Spezifität zu erzeugen und gleichzeitig die Hintergrundfärbung zu minimieren. Sobald die Bedingungen für die einzelnen Antikörper etabliert wurden, muss die optimale Reihenfolge für die Färbungs-Entwicklung bestimmt werden, um Unterschiede in der Reaktivität der Chromogene zu berücksichtigen. Zuletzt sollten die Ergebnisse der abgeschlossenen Doppelfärbungen mit den ursprünglich getesteten Einzelfärbungen verglichen werden. Falls notwendig sollten die Chromogen-Entwicklungszeiten angepasst werden, um ein Gleichgewicht zwischen den Signalen zu erreichen. Diese Schritte können auf eine jegliche Anzahl an Zielantigenen und Gewebeproben zugeschnitten werden, und ihre Einhaltung stellt das Vertrauen in die finale Auswertung einer IHC-Doppelfärbung sicher.

Wir möchten Sie dazu ermutigen, für mehr Details zu diesem Verfahren unseren neuen Anwendungshinweis zu beachten: Optimizing Immunohistochemistry Dual Staining to Visualize and Understand Protein Co-expression during EMT.

Nur für den Gebrauch zu Forschungszwecken. Nicht für den Gebrauch in diagnostischen Verfahren.

Themen: IHC

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