Wenn ich nur sehen könnte, was in meinem Gehirn vorgeht…


Eingestellt von Richard C am 05. Juni 2019 03:15:00

Die Anwendung der Immunhistochemie zur Erforschung des Gehirns in seinem anatomischen Kontext bedeutete für Generationen von Neurowissenschaftlern gewöhnlich, ein winziges Stück nach dem anderen abzubilden. Die Anwendung traditioneller Methodik, dass man Mikrometer-dünne Schnitte anfertigt, diese fixiert, färbt, bildlich erfasst und zum Schluss alle diese Schnitte zusammensetzt, ist eine höchst mühselige Arbeit – insbesondere bei großen Geweben. Wie wäre es, wenn Sie in ein intaktes Mausgehirn „hineinsehen“ und darin spezifische Zellen identifizieren könnten, ohne das ganze Schneiden und Zusammensetzen?

Um dies durchzuführen, müsste man jedoch einige Herausforderungen meistern. Sie müssten das Organ ausreichend und gleichmäßig fixieren, um seine Struktur sowohl auf der Gewebe- als auch der molekularen Ebene aufrechtzuerhalten. Nach der Fixierung müsste das Gewebe ausreichend porös sein, so dass Moleküle wie Antikörper das Organ vollständig durchdringen können. Sobald Sie dies bewerkstelligt haben, würden Sie die ganze Struktur effizient und wirklichkeitsgetreu abbilden wollen. Wie würden Sie eine solche Aufgabe lösen?

Versuchen Sie es mit Clearing-Methoden für komplette Gewebe. Ich selbst habe 2012 von dieser Idee erfahren. Als molekularer Neurobiologe habe ich zuvor immer traditionelle Immunfärbungstechniken angewendet, um die Frage zu beantworten, wann und wo mein Protein von Interesse in Zellen oder, besser noch, im Gehirngewebe selbst exprimiert wird. Ich war daher fasziniert von einem Poster der Society for Neuroscience mit dem Titel „Clarity: Technology for rapid, whole, intact-brain imaging with molecular phenotyping (1).” Ich nehme an, jeder Neurowissenschaftler wäre von diesem Titel fasziniert – WHOLE INTACT-BRAIN Imaging (Imaging eines kompletten intakten Gehirns) – falls Sie das von mir zwecks Betonung Fettgeschriebene in diesem Titel übersehen haben!

Was ich auf diesem Poster sah, war eine einzigartige Herangehensweise an das Gehirn-Imaging: Man mache das Gehirn vollständig transparent.

So wie es ist, ist das Gehirn normalerweise undurchsichtig, was das Imaging tief im Gewebe zum Problem macht. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, haben die Autoren eine neuartige Technik, genannt CLARITY, angewendet, um das Gewebe mit einem Hydrogel zu fixieren, das das Gewebe physisch unterstützt und seine molekulare Architektur aufrechterhält, und dann die Membranlipide zu entfernen. Das Ergebnis war ein komplett transparentes, vollständiges und intaktes Gehirn, das für die Färbung und das Imaging mit gewöhnlicher konfokaler Fluoreszenzmikroskopie zugänglich war. Im Jahr 2013 teilten sich die Autoren dieses Posters die vom Science Magazine verliehene Auszeichnung „Breakthrough of the Year“ – im selben Jahr, in dem auch bahnbrechende Erkenntnisse in der Krebs-Immuntherapie ausgezeichnet wurden (2).

Gehen wir 5 Jahre weiter und die Original-Technologie hat sich weiterentwickelt und ist jetzt allgemeiner als „Tissue Clearing“ bekannt. Die neuen Methoden, die iDisco, CUBIC, FRUIT und SHIELD/SWITCH umfassen, versuchen einige der Limitierungen zu umgehen, die mit der ursprünglichen CLARITY-Methode einhergingen. Die wichtigsten Optimierungen sind u. a. gleichmäßigere und/oder schnellere Färbungsmethoden, die die langen, komplexen Arbeitsabläufe und die harschen Behandlungsbedingungen des Originalprotokolls verbessern. Manche Behandlungsbedingungen verändern die Struktur des Gewebes / der Proteine, was zu einem Verlust der Signale von sowohl der Antikörper-basierten Färbung (aufgrund veränderter Zugänglichkeit des Antikörper-Epitops) und der verminderten Fluoreszenz genetisch codierter Tags wie GFP (aufgrund eines veränderten Fluoreszenzfarbstoffs) führt.  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Konfokale Rekonstitution eines Gehirns aus einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit, transparent gemacht und mit dem  β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb #8243 gefärbt. Bereitgestellt von Drs. Kwanghun Chung, Li-Huei Tsai und Kollegen.

Vor Kurzem beschrieb das Labor von Kwanghun Chung am MIT die SHIELD-Methode. Diese nutzt ein optimiertes Polyepoxid-Fixierungsprotokoll, das die Struktur des Gewebes wirklichkeitsgetreuer beibehält und die Fluoreszenz von GFP aufrecht erhält. Dies ist ein wirklicher Fortschritt, da genetisch kodiertes GFP weit verbreitet zur Markierung von Gehirnzellen und -strukturen angewendet wird. In Kombination mit Workflows zur aktiven Markierung, die Antikörper homogen über die relevanten Gewebe verteilen und Markierungszeiten verringern (siehe https://lifecanvastech.com/tissue-processing-21st-century/), stellen diese Methoden Fortschritte dar, die das Tissue Clearing zuverlässiger, effizienter und flexibler gestalten, und Forschern so die Beantwortung spezifischer biologischer Fragen ermöglichen.

Welche Arten von biologischen Fragestellungen können mit diesen Techniken des Tissue Clearings bearbeitet werden? Fragestellungen zum Schicksal von Zellen im Kontext bestimmter Gehirnregionen; die Kartierung bestimmter Zellpopulationen, um anatomische Schaltkreise zu erkennen; die Untersuchung synaptischer Feinstrukturen innerhalb eines intakten Gehirns, ohne Artefakte zu produzieren – all dies ist mit solchen Techniken nun möglich. Diese Fragestellungen sind nicht auf das Gebiet der Entwicklungs- oder Grundlagen-Neurowissenschaften limitiert, sondern können auch zum Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AK) angewendet werden.

Es wird angenommen, dass die dynamische Bildung, fortschreitende Entwicklung und Interaktion der pathologischen Hauptmerkmale der AK, die Beta-Amyloid (Aβ)-Plaques und neurofibrilläre Bündel (NFB) umfassen, zum Fortschreiten dieser Erkrankung beitragen. Aber wie? Mit welchen Zelltypen und/oder Strukturen interagieren Aβ-Plaques? Unterscheiden sich diese Wechselwirkungen in den frühen von solchen in späteren Stadien der Erkrankung? Beginnt die Erkrankung in einer bestimmten Gehirnregion, vielleicht mit NFPs in einem Unterabschnitt des Gehirns, etabliert sich dort und verbreitet sich dann über das ganze Gehirn? Was tritt als erstes auf: Aβ-Plaques oder NFBs? Ist dies vielleicht unterschiedlich je nach Erkrankungsstadium oder der Gehirnregion, die man sich ansieht?

Die Tissue Clearing-Techniken sind dazu geeignet, solche Fragen zu beantworten. Kann die Aβ-Landschaft, wenn man es so nennen will, in einem intakten Mausgehirn untersucht werden? Die Antwort ist: Ja. Ein Beispiel einer solchen Landschaft wurde von Kwanghun Chung in Zusammenarbeit mit Li Huei Tsai, beide vom MIT, erzeugt und zur Verfügung gestellt. Es stellt ein komplettes Gehirn einer 5XFAD-Maus dar, das mit dem β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb von CST gefärbt wurde. Mittels Anwendung der SHIELD Tissue Clearing-Technik zusammen mit den Antikörpern von CST beobachteten die Forscher Aβ-Plaques verteilt im ganzen Gehirn. Das Tissue Clearing des Gesamthirns wurde im Rahmen einer hochinteressanten Weiterentwicklung eingesetzt, die zu einer potentiellen Therapie für die AK führen könnte. Eine durch Gammafrequenzstimulation induzierte Reduktion von β-Amyloid (D54D2) in Plaques im Kontext eines kompletten Maushirns konnte so beobachtet werden (3, siehe Supplemental Figures S3 und 4).

Welche Zukunft könnte diese Technologie haben? Werden die Darstellung von extrem feinen Details bei Auflösungen, die über die Grenzen der optischen Beugung hinausgehen, mit Techniken wie der Expansionsmikroskopie Teil dieser Workflows sein (4, 5)? Wie kann diese Sintflut an Daten analysiert werden, um aussagekräftige biologische Einsichten zu gewinnen? Werden Unternehmen wie LifeCanvas (https://lifecanvastech.com/) Workflows entwickeln, die automatisierte Fixierungs- und Färbungsmaschinen nutzen und diese Technologie eventuell skalierbarer und schneller machen? Wie viel Antikörper-Optimierung wird von den Endnutzern erwartet werden, oder kann dies standardisiert werden? Können Tissue Clearing-Technologien auch zur Erforschung der Hauptmerkmale von Erkrankungen genutzt werden, die über das Gehirn hinaus gehen – wie die Tumor-Mikroumgebung? Diese Fragen werden sicherlich während der Weiterentwicklung dieses Forschungsgebiets adressiert werden. Zudem wird die vom NIH beigesteuerte Investition von 400 Million US-Dollar pro Jahr (6, siehe NIH BRAIN Initiative) zur Entwicklung solcher ganzheitlicher Technologien eine grosse Hilfe für Forscher sein, wenn es darum geht, zu sehen, was wirklich in unseren Gehirnen vorgeht.

Lesen Sie mehr über Neurodegeneration.

 

Literatur:

1  http://www.abstractsonline.com/Plan/ViewAbstract.aspx?sKey=b4200e23-ad5c-4c94-9c7e-bfd7369b0db6&cKey=88fb0d8a-4673-42ce-9acd-54f883fb1a2e&mKey=%7B70007181-01C9-4DE9-A0A2-EEBFA14CD9F1%7D
2  https://www.sciencemag.org/news/2013/12/sciences-top-10-breakthroughs-2013
3  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867419301631?via%3Dihub
4  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27454740
5  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30573813
6  https://www.braininitiative.nih.gov/

Nur für den Gebrauch zu Forschungszwecken. Nicht für den Gebrauch in diagnostischen Verfahren.

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