Vertrauenswürdige Maus-CD8- und Maus-FoxP3-Doppelfärbungen


Eingestellt von Tamar A. am 25. Sep. 2019 03:15:00

Die Immunhistochemie (IHC) ist seit Jahrzehnten eine leistungsstarke Technik zur Erforschung und Visualisierung von zellulären Komponenten in ihrem natürlichen histologischen Kontext. IHC has served as an important tool in medicine – enabling the diagnosis of complex pathological conditions – and in basic research to advance the understating of key biological processes. 

IHC-Protokolle beinhalten viele Schritte – von der Verarbeitung des Gewebes bis hin zum Nachweis des Signals –, die bei einer manuellen Durchführung erhebliche Zeit und das Fachwissen geübter Technischer Assistenten in Anspruch nehmen. In den letzten Jahren wurde der Prozess der IHC-Durchführung drastisch verbessert, indem automatisierte Methoden entwickelt wurden. Automatisierte Färbeapparate wie der Leica® Bond™ Autostainer ermöglichen ein Arbeitspensum mit erhöhtem Durchsatz, während sie gleichzeitig eine bessere Einheitlichkeit und Reproduzierbarkeit der Färbung bieten. Wie manuell durchgeführte Färbungen benötigt jedoch auch die automatisierte IHC das Anpassen jedes Protokolls an die speziellen Anforderungen des jeweiligen Experiments.

In einem anderen Blogbeitrag haben wir einen Überblick über das grundlegende Verfahren der IHC zur Verfügung gestellt sowie Leitfäden zur Optimierung des manuellen Nachweises zweier zu untersuchender Zielantigene – in diesem Fall mittels einer dualen Färbung mit Chromogenen, die ohne weiteres für die Anwendung auf einem Autostainer angepasst werden kann. Eine wesentliche Empfehlung zu dieser Methode war, validierte Antikörper für den Nachweis individueller Zielantigene auszuwählen, die in verschiedenen Wirtsarten erzeugt wurden.. Dadurch schränkt man die Möglichkeit von Kreuzreaktivitäten während der Signalauswertung ein. Der Luxus, validierte primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsarten zur Hand zu haben, ist jedoch nicht immer gegeben. In diesem Fall ist es notwendig, optimale Verfahren für die Doppelfärbung mit primären Antikörpern zu etablieren, die in derselben Wirtsart erzeugt wurden.

Screen Shot 2019-09-17 at 2.28.04 PMVergleich der Abbildungen von Einzelfärbungen für (A) FoxP3 (#12653)
und (B) CD8α (#98941) mit der optimierten Doppelfärbung (C).

Welches sind die erforderlichen Schritte zur Optimierung des sequenziellen Nachweisverfahrens zweier Antigene mittels IHC und primären Antikörpern, die in derselben Wirtsart erzeugt wurden? Wie bei der Verwendung primärer Antikörper aus unterschiedlichen Wirtsarten ist auch hier der erste Schritt, Kontrollfärbungen mit den einzelnen Paaren aus primärem Antikörper/Chromogen durchzuführen. Dies dient dazu, eine Ausgangsbasis für den Nachweis jedes Antigens festzulegen. Wegen der Unterschiede in der Bindungsaffinität und Reaktivität ist es wichtig, die primären Antikörper und die Chromogen-markierten sekundären Antikörper in unterschiedlichen Paarungen zu testen, um die beste Kombination herauszufinden.

Um die Kreuzreaktivität während des Nachweises des zweiten Zielantigens einzuschränken, ist es als nächstes entscheidend, einen Antikörper-Stripping-Schritt zu entwickeln und zu testen, damit übriggebliebener primärer Antikörper nach der Färbung auf das erste Zielantigen zuverlässig entfernt wird. Die Gründlichkeit des Strippens kann folgendermaßen überprüft werden: Führen Sie eine Inkubation des Gewebes mit dem primären Antikörper gegen Antigen Nr. 1 durch, entfernen Sie den Antikörper mit Stripping-Puffer und geben Sie dann die Nachweisreagenzien für das Antigen Nr. 2 hinzu. Jegliches Signal, das jetzt nachgewiesen werden kann, ist ein Hinweis auf das Vorhandensein von übriggebliebenem primärem Antikörper, der die Interpretation der Ergebnisse nach dem sequenziellen Nachweis des Antigens Nr. 2 beeinträchtigen könnte.

Die Optimierung des Strippings sollte für jedes Paar aus primärem Antikörper/Chromogen durchgeführt werden. Die Paare, die sich am effektivstes strippen lassen, bestimmen die Reihenfolge der Arbeitsschritte in der sequenziellen Färbung, d. h. das Antikörper/Chromogen-Paar, das im Stripping-Test wenig bis gar keine Färbung zeigt, sollte in der Doppelfärbung als erstes eingesetzt werden. Das Befolgen dieser Schritte stellt das Vertrauen in die finale Interpretation der Doppelfärbung mit primären Antikörpern sicher, die aus derselben Wirtsart stammen.

Wir möchten Sie dazu ermutigen, für mehr Details zu diesem Verfahren unseren neuen Anwendungshinweis zu beachten: Optimierung der Doppelfärbung für Maus-CD8 und Maus-FoxP3 auf dem Leica® Bond™.

Nur für den Gebrauch zu Forschungszwecken. Nicht für den Gebrauch in diagnostischen Verfahren.

Themen: IHC, Immunologie

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